GLP-1(pautan:https://www.bloomtechz.com/synthetic-chemical/peptide/glp-1-peptide-cas-87805-34-3.html) ialah hormon polipeptida yang terdiri daripada 30 asid amino. Dengan penyelidikan yang mendalam tentang GLP-1, semakin banyak kaedah sintetik telah dibangunkan. Artikel ini secara sistematik akan memperkenalkan kaedah sintesis GLP yang diketahui pada masa ini-1.
Kaedah 1, sintesis fasa pepejal:
Sintesis fasa pepejal ialah kaedah yang digunakan secara meluas untuk sintesis peptida dan protein, dan juga biasa digunakan untuk sintesis GLP-1. Dalam sintesis fasa pepejal, struktur teras dibentuk dengan menghubungkan asid amino pertama kepada resin. Seterusnya, asid amino seterusnya ditambah mengikut urutan dan bertindak balas secara kimia dengan agen pemeluwapan yang sesuai. Akhirnya, produk sasaran boleh diperolehi dengan membelah polipeptida daripada resin.
Kepentingan sintesis fasa pepejal ialah ia membolehkan automasi dan pengeluaran besar-besaran sintesis peptida. Kaedah sintesis fasa pepejal arus perdana termasuk Fmoc dan Boc. Antaranya, kaedah Fmoc menggunakan kumpulan pelindung N-Fmoc untuk melindungi peptida, manakala kaedah Boc menggunakan tert-butyloxycarbonyl untuk melindungi kumpulan karboksil.
Kaedah kedua, sintesis fasa cecair:
Sintesis fasa cecair ialah kaedah tradisional sintesis peptida di mana bahan tindak balas diletakkan dalam fasa cecair untuk tindak balas. Kelebihan sintesis fasa cecair ialah keadaan tindak balas adalah ringan dan sesuai untuk pengubahsuaian struktur kimia yang sensitif. Walau bagaimanapun, disebabkan terlalu banyak bahan tindak balas, proses penulenan agak rumit. Tindak balas kimia dalam sintesis fasa cecair termasuk:
1. Tindak balas pemeluwapan:
Tindak balas pemeluwapan adalah salah satu tindak balas paling asas dalam sintesis peptida, iaitu kumpulan karboksil yang dimulakan oleh agen pemeluwapan seperti DCC dan HOBt disambungkan kepada kumpulan amino asid amino melalui tindak balas asilasi. Keadaan tindak balas adalah ringan dan hasil adalah tinggi.
2. Tindak balas penyingkiran:
Tindak balas penyingkiran adalah untuk mengurangkan metionin kepada dithiol oleh NaBH4 dan agen penurunan lain, menjadikannya tidak aktif. Tindak balas perlu dijalankan di bawah keadaan asas.
3. Penyingkiran kumpulan yang melindungi:
Disebabkan oleh fungsi asid amino yang berbeza dalam rantaian peptida, kumpulan pelindung yang berbeza akan digunakan untuk perlindungan. Selepas sintesis selesai, kumpulan pelindung perlu dialih keluar. Untuk kaedah Fmoc, piperidine biasanya digunakan untuk mengeluarkan Fmoc; manakala untuk kaedah Boc, TFA digunakan untuk mengeluarkan Boc.
Kaedah ketiga, sintesis kimia:
GLP-1 ialah hormon polipeptida dengan aktiviti biologi yang penting. Sintesisnya boleh direalisasikan dengan pelbagai kaedah, antaranya sintesis kimia adalah salah satu kaedah yang paling biasa digunakan. Kelebihan sintesis kimia ialah ia boleh menghasilkan produk sasaran yang sangat tulen, yang sesuai untuk pengeluaran berskala besar. Kaedah sintesis kimia dan langkah terperinci GLP-1 akan diperkenalkan di bawah.
1. Laluan sintetik dan melindungi pemilihan kumpulan:
Molekul GLP-1 terdiri daripada 36 asid amino, termasuk 21 asid amino jenis L dan 15 jenis D. Sebelum menjalankan sintesis, adalah perlu untuk memilih laluan sintetik yang sesuai dan memilih kumpulan perlindungan yang sepadan mengikut keadaan sintetik. Sintesis fasa pepejal Fmoc biasanya digunakan untuk sintesis berskala besar automatik. Kaedah ini menggunakan N-9-perlindungan karboksil fluoroimido (N-Fmoc) sebagai kumpulan pelindung, dan juga perlu memilih kumpulan pelindung sekunder yang sesuai (seperti tert-butil atau metil) untuk memastikan perlindungan tapak tertentu. Setiap kali asid amino baharu ditambah, kumpulan pelindung Fmoc perlu dikeluarkan terlebih dahulu, dan kemudian bahan gandingan terlindung asid amino seterusnya ditambah.
2. Sintesis urutan asid amino teras:
Urutan teras GLP-1 terdiri daripada 21 asid amino, termasuk serin utama dan empat jujukan dipeptida asid prolyl-glutamic. Dalam sintesis fasa pepejal, sintesis jujukan teras boleh dibahagikan kepada langkah-langkah berikut:
2.1. Tambah asid asetik karbamat (Fmoc-NH-CH2CO2Et) dan 2-Cl-Trt-Cl kepada resin sintetik fasa pepejal, dan lakukan tindak balas pemeluwapan dengan agen gandingan DIC/NMM.
2.2. Alih keluar kumpulan pelindung Fmoc dengan menyahlindung tindak balas kumpulan.
2.3. Tambah asid amino seterusnya, ulangi langkah 1 dan langkah 2 dalam urutan sehingga urutan teras disintesis.
2.4. Pembentukan struktur pentapeptida pada resin fasa pepejal. Tambahkan reagen asetalisasi pada resin fasa pepejal, bertindak balas dengan agen pengecaman terminal-N (seperti HBTU), tambah kumpulan perlindungan rantai sisi serine sebagai agen pengurangan tambahan, dan kemudian keluarkan kumpulan perlindungan Fmoc.
2.5. Di bawah pemangkinan Bacillus subtilis transferase (ProTide), struktur pentapeptida mengalami tindak balas pertukaran dengan prekursor serine iodoacetate.
3. Sintesis urutan asid amino yang tinggal:
Selepas melengkapkan sintesis urutan teras, adalah perlu untuk terus menambah baki asid amino, termasuk asid amino jenis L dan D. Penambahan asid amino ini perlu bermula dari jujukan teras, menambah asid amino seterusnya dalam turutan, dan menggunakan agen pemeluwapan yang sepadan untuk menjalankan tindak balas kimia sehingga molekul polipeptida GLP-1 lengkap disintesis. Semasa proses ini, adalah perlu juga untuk memilih kumpulan pelindung yang sesuai seperti yang diperlukan, dan untuk melaksanakan langkah-langkah tindak balas, penyingkiran kumpulan pelindung dan penambahan asid amino mengikut urutan.
4. Rawatan natrium hidroksida:
Selepas semua asid amino telah ditambah, rantai peptida yang tidak disintesis sepenuhnya terbentuk pada resin fasa pepejal dan perlu diproses untuk membentuk molekul peptida yang terbentuk sepenuhnya. Pertama, peptida yang tidak terbentuk harus dihidrolisiskan oleh natrium hidroksida, supaya kumpulan karboksil terminal-C yang asalnya dilekatkan pada resin terlepas daripada resin, dan kumpulan pelindung terlepas di dalam air. Selepas tindak balas hidrolisis, produk sasaran diperolehi.
5. Pemendakan dan pencucian:
Selepas rawatan, larutan terhidrolisis dirawat dengan asid untuk memendakan produk sasaran. Seterusnya, pelet digantung semula dalam air, diikuti dengan pencucian intensif untuk menghilangkan kekotoran.
6. Pemurnian:
Langkah terakhir ialah penulenan produk yang diingini, biasanya menggunakan kromatografi cecair berprestasi tinggi. Semasa proses ini, ketulenan produk boleh ditentukan dengan mengesan puncak penyelesaian dalam spektrum jisim. Ringkasnya, sintesis kimia GLP-1 memerlukan beberapa pusingan tindak balas kompleks dan proses penulenan yang ketat untuk akhirnya memperoleh produk sasaran aktif.
Kaedah keempat, biosintesis:
GLP-1 ialah hormon polipeptida yang penting dengan pelbagai kesan fisiologi, termasuk menggalakkan rembesan insulin, menyekat selera makan, mengurangkan berat badan dan mengekalkan kepekaan insulin, dsb. Kaedah biosintesis GLP-1 terutamanya disintesis oleh sel L dalam kelenjar pankreas, dan kadar sintesisnya dikawal dengan pengambilan makanan. Langkah-langkah terperinci diperkenalkan seperti berikut:
1. Kerja persediaan sebelum sintesis:
Sebelum biosintesis GLP-1, beberapa kerja persediaan perlu dilakukan, termasuk menentukan jenis sel yang digunakan, menetapkan keadaan kultur dan memilih enzim pemangkin yang sesuai. Sel L ialah sumber utama sintesis GLP-1 kerana ia mengandungi prekursor dua hormon, GIP (peptida seperti glukagon 1) dan GLP-1. Sel L boleh diasingkan daripada epitelium usus arnab atau tikus. Sebelum biosintesis, sel perlu dibiakkan kepada bilangan yang mencukupi, dan nutrien yang mencukupi serta keadaan kultur yang sesuai harus disediakan. Di samping itu, adalah perlu untuk memilih enzim pemangkin yang sesuai untuk menggalakkan tindak balas.
2. Sintesis dan pemprosesan prekursor:
Biosintesis GLP-1 terutamanya berlaku dalam sel L, dan pendahulunya terdiri daripada dua hormon, GIP dan GLP-1. Selepas memasuki sel endokrin, GIP dan GLP-1 diproses oleh enzim proteolitik dan dibelah menjadi peptida individu. Satu siri enzim dan kofaktor terlibat dalam proses ini, termasuk prekursor polipeptida asidase (PC2), isomerase, dan faktor lekatan lewat.
3. Penukaran bersama antara segmen polipeptida:
Selepas pemprosesan, peptida GIP dan GLP-1 digabungkan semula untuk membentuk polipeptida-1 GLP. Proses ini memerlukan penggunaan peptida seperti glukagon 1 (GLP-1) sebagai templat yang mana peptida individu lain digabungkan untuk membentuk polipeptida komposit baharu. Proses ini juga memerlukan beberapa enzim dan faktor tertentu, termasuk Prohormone Convertase 1/3 (PC1/3) dan Carboxypeptidase E (CPE).
4. Rembesan GLP-1:
Selepas GLP-1 disintesis dan diproses, ia disimpan dalam sitoplasma dan vesikel dalaman sel endokrin. Apabila dirangsang oleh diet, sel endokrin membebaskan GLP-1 dan memasuki peredaran darah melalui saluran mikro. Proses ini dikawal dan dikawal melalui satu siri laluan transduksi isyarat, termasuk cAMP-Ca2 tambahdan sebagainya.
Ringkasnya, biosintesis GLP-1 melibatkan tindakan bersama pelbagai pautan dan faktor. Gabungan biosintesis dan sintesis kimia boleh memberikan asas dan sokongan yang lebih baik untuk penyelidikan dan pengeluaran GLP-1.
Kaedah kelima, sintesis enzimatik:
Sintesis enzimatik ialah sintesis rantai peptida melalui pemangkinan enzim biologi. Berbanding dengan kaedah sintesis fasa cecair tradisional, sintesis enzimatik boleh dijalankan pada suhu bilik, dan pelbagai bahan mentah boleh dipilih. Enzim seperti theta-liquid synthase, AEP, ACE, dsb. biasanya digunakan untuk memangkinkan sintesis.
Kesimpulannya, kaedah yang dinyatakan di atas ialah kaedah yang boleh dilaksanakan untuk sintesis GLP-1. Kaedah yang berbeza sesuai untuk keadaan eksperimen dan persekitaran pengeluaran farmaseutikal yang berbeza.